今天為大家介紹的是——染料廢水處理方法研究
一，引言(Introduction)
隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，我國(guó)已成為染料生產(chǎn)大國(guó)，但隨之而來(lái)產(chǎn)生了大量的染料廢水.除了大量殘留的染料外，染料廢水中還含有其他有毒有害成分，如重金屬離子.因此，染料廢水具有成分復(fù)雜、色度、濃度高、難生物降解、水量水質(zhì)變化大等特點(diǎn)，成為較難處理的工業(yè)廢水之一。
孔雀綠是常見(jiàn)的三苯基甲烷類染料之一，常作為絲織品、毛織品、棉布等的染色劑.雖然孔雀綠具有高毒性、致突變性和較強(qiáng)的生物毒性等特性，但因其成本低廉、殺菌效果顯著，因此，目前仍被廣泛應(yīng)用在紡織和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè).重金屬通常應(yīng)用于紡織染料工業(yè)的不同生產(chǎn)過(guò)程中，因此，染料廢水中存在各種不同濃度的重金屬，其中，Cr(Ⅵ)的含量比較高，而Cu(Ⅱ)次之.研究發(fā)現(xiàn)，極少量的重金屬離子就能產(chǎn)生明顯的中毒反應(yīng)，且通過(guò)食物鏈被較高級(jí)的生物成倍地富集在體內(nèi)，且會(huì)使生物體內(nèi)的酶、蛋白質(zhì)等失活，同時(shí)它無(wú)法被微生物降解，比較終累積在器官中，嚴(yán)重?fù)p害著人體健康和生態(tài)環(huán)境。染料廢水中殘留染料與重金屬離子經(jīng)常并存，這種復(fù)合污染具有更高的生物、細(xì)胞毒性。
染料脫色一般分為物理化學(xué)法和生物法，物化法使用方便、見(jiàn)效快，但成本高、二次污染嚴(yán)重;生物法運(yùn)行費(fèi)用低，處理效果顯著且不會(huì)造成二次污染，是環(huán)境友好的處理方法，因而受到廣泛關(guān)注。但重金屬通過(guò)影響微生物體內(nèi)酶的生成或酶的活性抑制微生物對(duì)染料的降解。因此，如何提高染料與重金屬構(gòu)成的復(fù)合污染中染料的生物降解效率成為該類廢水處理的難點(diǎn)之一.
EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)是一種常見(jiàn)的鰲合劑，生成的絡(luò)合物在中性或堿性條件下穩(wěn)定系數(shù)非常大.在一般情況下，這些螯合物的配合比都是1:1(鞠峰等, 2011).EDTA與配位離子形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，金屬離子取代配位原子上的氫而進(jìn)入鰲合環(huán)中，使金屬離子鈍化，降低其毒害作用。但目前關(guān)于采用環(huán)境中廣泛存在的螯合劑減少與染料共存的重金屬離子的毒性，提高染料降解效率的研究少有報(bào)道.根據(jù)之前的研究發(fā)現(xiàn)，某些微生物可能會(huì)將Cr(Ⅵ)還原成Cr(Ⅲ)，因此，本研究擬采用EDTA降低Cr(Ⅵ)的毒性，從而提高Cr(Ⅵ)共存時(shí)微生物降解孔雀綠的效率.采用篩選出的高效好氧菌Burkholderia cepacia C09G降解孔雀綠，研究EDTA對(duì)重金屬共存時(shí)降解孔雀綠的影響，同時(shí)優(yōu)化EDTA鰲合Cr(Ⅵ)的比較佳濃度.通過(guò)此研究以提高在重金屬共存時(shí)染料的去除效率，為復(fù)雜廢水的治理奠定一定的理論基礎(chǔ).
二，材料與方法(Materials and methods)
2.1 試劑與儀器
試劑：葡萄糖、KH2PO4、Na2HPO4·2H2O、MgSO4、FeCl3·6H2O、KNO3、孔雀綠(MG)、K2CrO7、EDTA等均為分析純.
儀器：SKY-2102型立式雙層恒溫培養(yǎng)搖床、SPX-2508-Z型生化培養(yǎng)箱、722N型可見(jiàn)光光度計(jì)、PHS-3C型精密pH計(jì)、AA-240型原子吸收光譜儀.
2.2 試驗(yàn)菌種與培養(yǎng)基
本試驗(yàn)所用菌種為Burkholderia cepacia C09G(B. Cepacia C09G).LB培養(yǎng)基：牛肉膏5 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，分裝在100 mL的三角燒瓶中，每瓶裝量為30.0 mL，121 ℃滅菌15 min.降解培養(yǎng)基：葡萄糖6.0 g·L-1，KH2PO4 1.8 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 3.5 g·L-1，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.01 g·L-1，MgSO4 0.1 g·L-1，KNO3 3.5 g·L-1，調(diào)節(jié)至pH 6.0，分裝于250 mL的三角燒瓶中，121 ℃滅菌15 min.
2.3 試驗(yàn)方法2.3.1 菌液的制備
將菌株B. Cepacia C09G接種到滅菌后的LB培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r·min-1的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，并將所得菌液轉(zhuǎn)移至50.0 mL離心管中，7000 r·min-1離心10 min，棄除上清液，用無(wú)菌水稀釋成菌懸液，4 ℃保存?zhèn)溆?
2.3.2 MG和Cr(Ⅵ)去除試驗(yàn)
將已算好體積的藥品加入降解培養(yǎng)基中，每支玻璃離心管(無(wú)菌)中加入15.0 mL的降解培養(yǎng)液，再加入菌液(初始OD600=0.7，體積比6%)，塞上棉花塞，放入搖床(150 r·min-1，30 ℃)培養(yǎng)0、12、24、36、48、60 h后分別測(cè)定OD600、MG和Cr(Ⅵ)濃度.上述每個(gè)試驗(yàn)均做3個(gè)平行，結(jié)果取其平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差.
2.4 生物量、MG及Cr(Ⅵ)的測(cè)定
從恒溫?fù)u床中取出各時(shí)段的降解培養(yǎng)基，在比較大吸收波長(zhǎng)600 nm處用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其吸光度，以波長(zhǎng)600 nm處的光密度OD600表示細(xì)菌生長(zhǎng)量.
取上清液，孔雀綠(MG)采用分光光度計(jì)測(cè)定619 nm處比較大吸收峰的吸光度值，以A619表示;利用原子吸收光譜儀測(cè)定溶液剩余Cr(Ⅵ)濃度.去除率R計(jì)算公式如下：
(1)
式中，C0表示初始時(shí)MG或Cr(Ⅵ)的濃度(mg·L-1);Ct表示t時(shí)MG或Cr(Ⅵ)的濃度(mg·L-1).
2.5 表征
掃描電子顯微鏡(SEM)觀察：采用JSM-7500型掃描電子顯微鏡觀察樣品的表面形貌和微觀形態(tài);X射線能量色散譜(EDS)分析：利用與SEM聯(lián)機(jī)的X射線能量散射儀分析樣品表面的元素種類和含量;傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析：采用Thermo Nicolet 5700紅外光譜儀，獲取試樣的FTIR譜圖，溴化鉀壓片，掃描范圍為4000~400 cm-1;X射線光電子能譜(XPS)分析：采用VG ESCALAB 250型X射線光電子能譜儀對(duì)吸附孔雀綠和Cr(Ⅵ)后的Burkholderia cepacia C09G進(jìn)行分析.
三，結(jié)果與討論(Results and discussion)
3.1 不同條件對(duì)孔雀綠降解過(guò)程的影響
所有實(shí)驗(yàn)均用Burkholderia cepacia C09G降解0.1 mmol·L-1孔雀綠，僅加入孔雀綠的為空白實(shí)驗(yàn)，其他實(shí)驗(yàn)再分別加入0.5 mmol·L-1 Cr(Ⅵ)、0.5 mmol·L-1 EDTA，以及同時(shí)加入0.5 mmol·L-1 Cr(Ⅵ)和0.5 mmol·L-1 EDTA，放入搖床中好氧培養(yǎng)0、12、24、36、48、60 h后取出測(cè)定OD600、A619、Cr濃度.
3.1.1 OD600
如圖 1所示，在空白實(shí)驗(yàn)中(沒(méi)有重金屬Cr(Ⅵ)或者EDTA存在的條件下)，即僅加入0.1 mmol·L-1的孔雀綠(MG)時(shí)，B. Cepacia C09G在前36 h快速生長(zhǎng)，OD600接近了0.7，而后因?yàn)镸G基本降解完，缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生物量增長(zhǎng)緩慢，60 h后比較終OD600值為0.78;僅加入0.5 mmol·L-1 Cr(Ⅵ)，對(duì)微生物的生長(zhǎng)有很強(qiáng)的抑制作用，生物量很低，僅為0.15;僅加入0.5 mmol·L-1 EDTA，毒性雖然比Cr(Ⅵ)更小，但仍有一定的抑制作用，60 h時(shí)OD600為0.31.據(jù)報(bào)道，EDTA和EDTA-Metal對(duì)土壤微生物都是有毒的(Grcman et al., 2001).當(dāng)同時(shí)添了EDTA和Cr(Ⅵ)時(shí)，OD600為0.42，大于單獨(dú)加入Cr(Ⅵ)或者EDTA時(shí)，說(shuō)明其生物毒性比單獨(dú)加入Cr(Ⅵ)或EDTA有所降低，因此，可以推測(cè)EDTA可以有效降低Cr(Ⅵ)的毒性.
圖 1不同條件下孔雀綠(MG)的OD600值
3.1.2 孔雀綠(MG)去除率
圖 2a為不同條件對(duì)孔雀綠的降解影響，在僅加入0.1 mmol·L-1 MG的情況下，MG在24 h的去除率達(dá)到96.2%;只添加0.5 mmol·L-1 Cr(Ⅵ)，60 h時(shí)MG的去除率均為6.7%，單獨(dú)添加0.5 mmol·L-1 EDTA時(shí)，60 h時(shí)MG的去除率為48.4%，說(shuō)明Cr(Ⅵ)和EDTA均會(huì)抑制B. Cepacia C09G對(duì)孔雀綠的降解.同時(shí)添加EDTA和Cr(Ⅵ)時(shí)，60 h MG的去除率上升到18.8%，相對(duì)于單獨(dú)加Cr(Ⅵ)的降解率有所提高，可以看出，EDTA確實(shí)可以有效地降低Cr(Ⅵ)的抑制作用，從而提高對(duì)孔雀綠的降解效率.也有研究證實(shí)，加入EDTA可以降低5 μmol·L-1 Cd、Cu和Zn對(duì)細(xì)菌Escherichia coli的毒性(Campbell et al., 2000).
圖 2不同條件下孔雀綠降解率(a)和Cr去除率(b)
3.1.3 Cr去除率
圖 2b為離心后的降解培養(yǎng)基中總Cr濃度，可能是由于EDTA可以有效螯合Cr，因此，減少了B. Cepacia C09G吸附Cr的效率，去除率從25.7%降低到15.2%.
3.2 0.5 mmol·L-1 EDTA螯合的比較佳Cr濃度
將菌株C09G加入初始Cr(Ⅵ)濃度分別為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mmol·L-1，EDTA濃度為0.5 mmol·L-1，MG濃度為0.1 mmol·L-1的降解培養(yǎng)基中，放入搖床中好氧培養(yǎng)0、12、24、36、48、60 h后取出測(cè)定OD600、A619、Cr的濃度.
3.2.1 OD600
如圖 3a所示，隨著加入Cr(Ⅵ)濃度的升高，生物量OD600先升高后降低，加入Cr(Ⅵ)濃度為0.7 mmol·L-1時(shí)達(dá)到比較高.在加入的Cr(Ⅵ)濃度分別為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mmol·L-1時(shí)，60 h時(shí)OD600分別為0.45、0.55、0.72、0.62、0.43，微生物生長(zhǎng)良好，因此，EDTA可適度地降低Cr的毒性.但總的來(lái)說(shuō)，Cr單獨(dú)存在，或者與EDTA形成螯合物，對(duì)微生物都是有毒的，因而生物量都偏低.
圖 3不同初始Cr(Ⅵ)濃度下OD600值(a)、孔雀綠降解率(b)和Cr去除率(c)
3.2.2 孔雀綠(MG)去除率
由圖 3b可知，除Cr(Ⅵ)濃度為0.7、0.8 mmol·L-1外，其余Cr(Ⅵ)濃度條件下的MG降解并不理想，均小于20%;而Cr(Ⅵ)初始濃度為0.7 mmol·L-1時(shí)，MG的去除率為35.3%，當(dāng)濃度增加到0.8 mmol·L-1時(shí)，MG的降解率下降到了30.7%.因此，確定0.5 mmol·L-1 EDTA存在下，螯合的比較佳Cr(Ⅵ)濃度為0.7 mmol·L-1. EDTA和重金屬的螯合比例一般為1:1(鞠峰等, 2011)，Cr(Ⅵ)以陰離子存在，不能和EDTA螯合，但根據(jù)報(bào)道，Cr(Ⅵ)會(huì)被微生物還原成Cr(Ⅲ)(甘莉等, 2014).因此推測(cè)，部分Cr(Ⅵ)會(huì)被微生物還原成Cr(Ⅲ)，被還原的Cr(Ⅲ)跟EDTA螯合，減少了毒性.EDTA或者Cr(Ⅵ)過(guò)量，MG去除率都會(huì)降低.
3.2.3 Cr去除率
如圖 3c所示，Cr(Ⅵ)初始濃度分別為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mmol·L-1時(shí)，總Cr的去除率分別為15.8%、21.6%、24.6%、21.8%、20.9%.Cr去除率隨著加入的Cr(Ⅵ)濃度增加而增加，當(dāng)Cr(Ⅵ)為0.7 mmol·L-1時(shí)Cr去除率比較高，之后開(kāi)始下降，但降低幅度很小.可能是因?yàn)楦邼舛鹊腃r傳質(zhì)效果更好，因而更易于被微生物富集.相對(duì)于無(wú)EDTA存在情況下，B. Cepacia C09G對(duì)Cr吸附率略有下降，但在比較佳的螯合濃度下，由于減少了Cr的毒性，增加了生物量，使得吸附率有所提高.但總的來(lái)說(shuō)，在EDTA存在條件下，B. Cepacia C09G對(duì)Cr吸附能力均較低.
3.3 降解過(guò)程的表征3.3.1 XPS
為了檢測(cè)Cr(Ⅵ)價(jià)態(tài)變化，采用X射線光電子能譜(XPS)分析吸附孔雀綠和Cr(Ⅵ)后的Burkholderia cepacia C09G，圖 4是菌體表面Cr的2p軌道核心區(qū)域的XPS光譜圖及其擬合曲線.可以看出，Cr2p1/2的結(jié)合能在584.0 eV處，而Cr2p3/2的結(jié)合能在577.4 eV處，可知兩個(gè)能值與Cr(Ⅲ)的結(jié)合能相對(duì)應(yīng)，這說(shuō)明在菌體表面應(yīng)該存在Cr(Ⅲ)，而吸附前，培養(yǎng)基中只有Cr(Ⅵ)，因此，推測(cè)培養(yǎng)基中Cr(Ⅵ)在Burkholderia cepacia C09G的作用下被吸附到其表面后，利用菌體內(nèi)的還原酶，Cr(Ⅵ)被還原為Cr(Ⅲ).其他文獻(xiàn)也有類似報(bào)道，細(xì)菌可利用細(xì)胞NADH作為還原劑，在好氧或厭氧狀態(tài)下，將高毒性的Cr(Ⅵ)直接還原成低毒的Cr(Ⅲ)(Lira-Silva et al., 2011)，如利用Burkholderia vietnamiensis C09V同時(shí)去除結(jié)晶紫和Cr(Ⅵ)時(shí)，該菌在降解結(jié)晶紫的同時(shí)將Cr(Ⅵ)還原成Cr(Ⅲ)(甘莉等, 2014).
圖 4吸附后Burkholderia cepacia C09G的Cr2p能譜圖
3.3.2 SEM
由圖 5a可知，當(dāng)溶液中只有孔雀綠存在時(shí)，B. Cepacia C09G細(xì)胞形態(tài)幾乎沒(méi)有破損，細(xì)胞表面完整圓滑飽滿、生長(zhǎng)良好.當(dāng)孔雀綠溶液中加入0.5 mmol·L-1 EDTA時(shí)，細(xì)胞形態(tài)有些略微的損傷(圖 5b).當(dāng)加入Cr(Ⅵ)后，微生物細(xì)胞表面嚴(yán)重受損，細(xì)胞表面凹凸不平且變得干癟(圖 5c).如圖 5d所示，同時(shí)加入0.5 mmol·L-1 EDTA和0.5 mmol·L-1 Cr(Ⅵ)后，與只加EDTA相比，對(duì)細(xì)胞形態(tài)影響相對(duì)較小，與不加EDTA與Cr(Ⅵ)的細(xì)胞形態(tài)相比雖然能維持較完整的細(xì)胞形態(tài)，還是有略微損傷.從圖 5中可以看出，EDTA與Cr(Ⅵ)都能破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，從而降低微生物的活性，同時(shí)加入EDTA和Cr(Ⅵ)后，EDTA減少了Cr(Ⅵ)對(duì)B. Cepacia C09G的毒性.
圖 5降解后Burkholderia cepacia的SEM圖(10000×)(a.0.1 mmol·L-1 MG, b. 0.1 mmol·L-1 MG+0.5 mmol·L-1 EDTA, c. 0.1 mmol·L-1 MG+0.5 mmol·L-1 Cr(Ⅵ), d.0.1 mmol·L-1 MG+0.5 mmol·L-1 EDTA+0.5 mmol·L-1 Cr(Ⅵ))
3.3.3 EDS
通過(guò)EDS確定菌株B. Cepacia C09G生物吸附MG、Cr(Ⅵ)或者EDTA后菌株局部所含元素，從圖 6中可以看出，圖中均含有C、K、O、Na、P，這些元素主要是來(lái)自于微生物自身;此外，圖 6b和6c中還含有Cr，這表明菌株有效地吸附了Cr，來(lái)源于溶液中加入的K2Cr2O7.圖 6b和6c中分別在0.48、5.40和5.96 keV處出現(xiàn)峰，顯示存在Cr元素，這就證明了C09G菌在去除孔雀綠的同時(shí)也可以吸附Cr.而且在圖 6c與6b的對(duì)比中可以看出，當(dāng)加入了EDTA后，Cr的含量明顯減少，從0.59%降低到0.37%，說(shuō)明EDTA相比于菌株對(duì)Cr的親和力更強(qiáng).
圖 6降解后Burkholderia cepacia的EDS圖(a. 0.1 mmol·L-1 MG, b. 0.1 mmol·L-1 MG+0.5 mmol·L-1Cr(Ⅵ), c.0.1 mmol·L-1 MG+0.5 mmol·L-1 EDTA+0.5 mmol·L-1 Cr(Ⅵ))
3.3.4 FTIR
圖 7為菌株B. Cepacia C09G吸附孔雀綠及孔雀綠和Cr(Ⅵ)后的FTIR光譜圖.由圖 7可知，2939~2927 cm-1處的峰是—CH、—CH2及—CH3的不對(duì)稱振動(dòng)峰，在1655 cm-1和1546 cm-1處出現(xiàn)由氨基酸I的—NH2與氨基酸II的—COOH形成的—NH/CO的伸縮振動(dòng)吸收峰，1408~1405 cm-1處分別為孔雀綠及降解產(chǎn)物芳環(huán)上的C=C的伸縮振動(dòng)峰和O—H的彎曲振動(dòng)峰.圖 7b相比于圖 7a，在2452 cm-1和845 cm-1處的峰消失，1070 cm-1處峰的產(chǎn)生是由于氨基酸的—NH轉(zhuǎn)變?yōu)镃=N共軛鍵.這說(shuō)明菌株C09G的去除過(guò)程主要是—OH、—COOH、—NH2、—NH/CO等官能團(tuán)與Cr相互作用(Nandi et al., 2009).
圖 7菌株B. Cepacia C09G吸附孔雀綠(a)及孔雀綠和Cr(Ⅵ) (b)后的FTIR光譜圖
四，結(jié)論(Conclusions)
1) 0.1 mmol·L-1孔雀綠單獨(dú)存在條件下，24 h的生物降解率達(dá)到96.2%;然而，在0.5 mmol·L-1 Cr(Ⅵ)共存時(shí)，60 h的降解率僅為6.7%;當(dāng)加入0.5 mmol·L-1 EDTA螯合劑后，60 h時(shí)孔雀綠的降解率提高到18.8%.說(shuō)明Cr(Ⅵ)、EDTA都會(huì)抑制孔雀綠的降解，加入0.5 mmol·L-1 EDTA螯合Cr后，可顯著降低Cr的毒性.
2) 對(duì)于0.5 mmol·L-1 EDTA，比較佳螯合Cr(Ⅵ)的濃度為0.7 mmol·L-1，此時(shí)，60 h的孔雀綠降解率上升到35.3%，Cr吸附率為24.6%，生物量也有所提高.
3) XPS表征證明，Burkholderia cepacia C09G可將Cr(Ⅵ)還原為Cr(Ⅲ);從SEM圖譜可知，加入EDTA后，降低了Cr對(duì)B. Cepacia C09G的毒性;EDS證實(shí)加入EDTA后，降低了B. Cepacia C09G對(duì)Cr的吸附效率;FTIR說(shuō)明，菌株C09V的去除過(guò)程主要是—OH、—COOH、—NH2、—NH/CO等官能團(tuán)與Cr相互作用.
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